Этот храм за Третьяковской галереей включен в ее комплекс. Вся церковная утварь, используемая в богослужениях, — из коллекции Третьяковки. А после службы церковь превращается в выставочный зал.
В то время здесь еще была Толмачевская слобода — поселение устных переводчиков. Она появилась еще во время татаро-монгольского ига. Но постепенно в Толмачах стали селиться купцы, которые активно жертвовали Церкви.
В разное время храм достраивали: в 1770 году в трапезной появился Покровский придел, в 1834 перестроили трапезную по проекту Ф.М. Шестакова и поставили новую колокольню, в 1856 году поновили четверик и перестроили главный алтарь. А в 1812 году московский пожар чудесным образом не тронул Никольский храм, хотя его приход выгорел дотла.
Известно, что ревностным прихожанином и благотворителем храма Святого Николая в Толмачах был Павел Третьяков. По его просьбе в ограде устроили калитку, соединявшую церковь с усадьбой Третьяковых в Лаврушенском переулке. Сейчас мемориальная табличка отмечает место, где молился Павел Михайлович.
В 1929 году Никольский храм закрыли, чтобы устроить в здание хранилище Третьяковской галереи. Тогда разрушили главы церкви и снесли три из четырех ярусов колокольни.
Богослужения возобновились в 1993 году. Через 6 лет завершили реставрацию храма в Толмачах. Средства на восстановление церкви выделила Третьяковская галерея. Тогда в росписях появились образы служившего здесь Алексия Зосимовского и последнего настоятеля Никольского храма Ильи Четверухина. При этом отец Илья, вопреки православным канонам, изображен в очках.
В 2000 году сюда перенесли главную православную святыню России — Владимирскую икону Божьей Матери. Сам храм стал домовой церковью при Третьяковке, а его хор одновременно является хором галереи.
Сначала образ хранился в Киеве. Затем Андрей Боголюбский перевез икону во Владимир. Во время нашествия хана Тамерлана образ Владимирской Богоматери перенесли в Москву для защиты города.
Трижды икона спасала столицу от татаро-монгол — в 1385 году, в 1450 и 1480. Каждый раз ее крестным ходом обносили вокруг города. Защитила Владимирская икона Москву и во время Великой Отечественной войны. По легенде, осенью 1941 года, когда фашисты рассматривали столичные окраины в бинокли, а надежды отстоять город уже практически не было, по приказу Сталина самолет со святым образом трижды облетел вокруг города. И на самых подступах к Москве врага остановили.
Владимирская икона присутствовала при избрании всех российских митрополитов и патриархов. До 1918 года она стояла в Успенском соборе. Потом образ передали в Государственный Исторический музей, а в 1930 году — перенеси на хранение в Третьяковскую галерею.
Сегодня Владимирская икона Божией Матери стоит в специальном пуленепробиваемом киоте. Всего в храме Николы в Толмачах около 150 редких и чтимых икон XVI-XX веков.
